Ферментативное мечение ДНК в полимеразной цепной реакции с помощью флуоресцентных трифосфатов
Флуоресцентно-меченые трифосфаты используют для включения флуоресцентной метки в растущую цепь ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В ходе амплификации с добавлением в реакционную смесь меченых дезоксинуклеотидов происходит их ферментативное встраивание и наработка меченого ПЦР-продукта Taq-полимеразой. Введение флуоресцентных меток непосредственно в процессе ПЦР имеет преимущества в условиях ограниченного количества ДНК-матрицы или необходимости наработки определенного фрагмента ДНК.
В данном протоколе приведены общие рекомендации по постановке ПЦР с флуоресцентно-мечеными трифосфатами и последующей детекции полученного продукта амплификации в агарозном геле. Указанные ниже параметры (включая программу амплификации, концентрацию ДНК-матрицы, праймеров и флуоресцентного дезоксинуклеотида, а также количество ПЦР-продукта, вносимого в агарозный гель) рекомендуется оптимизировать под конкретные условия эксперимента.
Для амплификации ДНК, меченой флуоресцентными трифосфатами, можно использовать 5-кратную реакционную смесь ProbeMaster® UNI (в состав которой входит HS Taq-ДНК-полимераза, реакционный буфер с Mg2+ и смесь немеченых трифосфатов).
Приготовление раствора флуоресцентного трифосфата
- Растворите лиофилизированный флуоресцентный трифосфат деионизированной водой до стоковой концентрации 1 мМ* (например, к 50 нмоль лиофилизата добавьте 50 мкл воды).
- Тщательно перемешайте раствор, сбросьте капли центрифугированием. Важно! Полученный раствор флуоресцентного трифосфата рекомендуется хранить в темноте, а дальнейшую экспериментальную работу проводить в условиях низкой освещенности.
* — разведение лиофилизата до стоковой концентрации 1 мМ и добавление удобно отмеряемого объема раствора трифосфата в ПЦР-смесь (3,5–7 мкл на объем реакции 35 мкл, см. пункт 1 раздела «Мечение ДНК») повышает точность внесения необходимого количества модифицированного трифосфата в реакцию.
Мечение ДНК
- Смешайте компоненты для необходимого числа реакций мечения согласно приведённой ниже таблице. Готовую смесь
перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
Расчет на 1 реакцию объемом 35 мкл**:
Компонент Объем Примечание Реакционная смесь для ПЦР ProbeMaster UNI, 5x 7 мкл — Прямой праймер 0,7–2,1 мкл 10 мкМ раствора Конечная концентрация
200–600 нМОбратный праймер 0,7–2,1 мкл 10 мкМ раствора Флуоресцентно-меченый трифосфат 3,5–7 мкл 1 мМ раствора Конечная концентрация
0,1–0,2 мМ***Деионизированная вода Добавляется до общего объема реакции 35 мкл** — ДНК Объем образца рассчитывается в зависимости от типа и концентрации ДНК-матрицы. В качестве матрицы может быть использована плазмидная (1–100 пг), геномная (50–100 нг) ДНК и др. Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. пункт 3) Общий объем реакции 35 мкл** ** – при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций*** – количественное содержание флуоресцентного трифосфата может повлиять на выход ферментативной реакции и степень мечения продукта. Для реакций мечения флуоресцентные трифосфаты рекомендуется добавлять в ПЦР-смесь до конечной концентрации 0,1–0,2 мМ (т.е., в соотношениях 0,5:1 – 1:1 к соответствующему немеченому трифосфату), однако для каждого типа меченого трифосфата советуем отдельно подбирать его наиболее оптимальную концентрацию в реакционной смеси. Увеличение концентрации меченых дезоксинуклеотидов в реакции может приводить к ингибированию ПЦР.Важно! При добавлении флуоресцентных трифосфатов количество наработанного ПЦР-продукта может быть ниже, чем при использовании в реакции только немеченых нуклеотидов. - В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
- Отдельно в каждую пробирку внесите недостающий объем образца ДНК. Закройте крышки пробирок, сбросьте капли центрифугированием.
- Проведите стандартную амплификацию ДНК с использованием нижеуказанной программы.
Стадия Температура Время Число циклов Первичная денатурация, активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1 Денатурация 95°С 10–30 с 25–35 Отжиг праймеров Рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров 10–30 с Элонгация 72°С 15–60 с (время элонгации зависит от длины ампликонов) Финальная достройка цепи 72°С 5 мин 1 - Флуоресцентно-меченый ПЦР-продукт может быть визуализирован на агарозном геле без дополнительного добавления к образцу интеркалирующего красителя.
- Поскольку флуоресценция свободных меченых нуклеотидов может затруднить визуальную детекцию полученного ПЦР-продукта на гель-электрофорезе, дополнительно рекомендуется провести очистку ДНК от невстроившихся трифосфатов.
Очистка ДНК от трифосфатов
Для получения ярких видимых полос на агарозном геле и удаления бóльшей части свободных флуоресцентных трифосфатов рекомендуется концентрировать ДНК переосаждением ПЦР-продукта этанолом из одной или нескольких пробирок с продуктами амплификации (предварительно объединив их в одну пробирку).
Для полного удаления флуоресцентных дезоксинуклеотидов рекомендуется проведение дополнительной очистки полученного ПЦР-продукта с помощью гель-фильтрации на колонках или ультрафильтрации.
- К ПЦР-продукту (из одной или нескольких пробирок) добавьте 1/2 объема 5 М раствора ацетата аммония и 2,5–3 объема 96% этанола (например, на каждые 35 мкл раствора с ПЦР-продуктом добавьте 17,5 мкл 5 М ацетата аммония и 87,5–105 мкл 96% этанола). Для лучшей визуализации осадка ДНК на этом этапе мы рекомендуем добавлять соосадитель (для этих целей можно использовать линейный полиакриламид).
- Для эффективного осаждения ДНК инкубируйте смесь при низких температурах (например, в течение 30–60 минут при −20°С).
- Центрифугируйте смесь не менее 15 минут при 10 000–12 000 × g, после чего аккуратно удалите супернатант, не задевая осадок.
- Промойте осадок холодным 70% этанолом, тщательно удалите супернатант.
- Растворите осадок в 10–20 мкл (в зависимости от желаемой концентрации меченой ДНК после очистки и, соответственно, яркости полос конечного продукта на агарозном геле) воды или элюирующего буфера.
- При необходимости продукты амплификации можно хранить при −20°С.
Электрофорез
- Смешайте образцы с буфером для нанесения на агарозный гель и внесите в лунки геля 5 мкл образца, проведите электрофорез. Для лучшей визуализации флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта может потребоваться внесение бóльшего количества образца в лунку, либо растворение ДНК в меньшем объеме элюирующего буфера.
- По окончании гель-электрофореза осуществите детекцию флуоресценции меченой ДНК с помощью УФ-трансиллюминатора или гель-документирующей системы с применением подходящего светофильтра, в зависимости от спектра эмиссии используемого флуоресцентного трифосфата. Важно! Мечение ДНК с использованием модифицированных трифосфатов может вызывать изменения электрофоретической подвижности ПЦР-продукта в агарозном геле.
- После детекции меченой ДНК инкубируйте гель в растворе красителя (например, dsGreen, dsGold, бромистого этидия) для визуализации немеченого контрольного ПЦР-продукта и маркера длин ДНК. Важно! После окрашивания геля флуоресценция меченого ПЦР-продукта может перекрываться с флуоресценцией красителя для геля, поэтому рекомендуется зафиксировать флуоресценцию ДНК до инкубации агарозного геля в растворе красителя.
