Реакционная смесь для ПЦР/кПЦР ProbeMaster®️ UNI, 5x
Реакционная смесь для ПЦР 5x подходит как для проведения ПЦР в режиме реального времени, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. Готовая 5-кратная реакционная смесь содержит необходимые компоненты для проведения ПЦР (hot-start полимеразу, dNTPs, Mg2+ и компоненты буфера), кроме олигонуклеотидов, ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. В случае постановки ПЦР в режиме реального времени, для детекции флуоресценции следует использовать ДНК-зонд, меченный флуорофором и тушителем (гидролизуемые зонды, «молекулярные маяки», праймеры типа «скорпион») или два зонда, меченных флуорофорами, образующими FRET-пару (вы можете заказать синтез зондов в Lumiprobe ). Помимо ДНК-зондов, для детекции флуоресценции может использоваться интеркалирующий краситель Eva488 (Eva488). Из-за отсутствия в составе UDG/dUTP Реакционная смесь для ПЦР 5x может использоваться для рутинных задач по клонированию и других задач, требующих дальнейшего использования продукта ПЦР после амплификации. Объем смеси 500 мкл рассчитан на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
Состав реакционной смеси: HS Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер (содержит Mg2+).
Совместимость с оборудованием: совместим с амплификаторами любого типа.
Возможные приложения: ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с детекцией методом электрофореза, ПЦР с образцами кДНК после обратной транскрипции, генотипирование, ПЦР для проверки колоний, получение продукта для ТА-клонирования и др.
Протокол
- Разморозьте реакционную смесь, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
- Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли
центрифугированием.
! Для получения воспроизводимых результатов кПЦР рекомендуется ставить реакции в 2 и более
повторах для каждого образца ДНК.
! Объем реакции может варьироваться в зависимости от конкретной
задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется.
Расчет на 1 реакцию ПЦР в режиме реального времени объемом 25 мкл:
* при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций Расчет на 1 реакцию стандартной ПЦР объемом 25 мкл:
Компонент Количество на 25 мкл реакции Примечание Реакционная смесь для ПЦР 5x 5 мкл Прямой праймер 200–400 нМ
Удобно добавлять в виде 10 мкМ стокаОбратный праймер 200–400 нМ Зонд
— или —100–300 нМ Интеркалирующий краситель Согласно рекомендации производителя Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл ДНК 2–9 мкл
(кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3) Общий объём реакции 25 мкл* * при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорцийКомпонент Объем Примечание Реакционная смесь для ПЦР 5x 5 мкл Прямой праймер 200–600 нМ Удобно добавлять в виде 10 мкМ стока Обратный праймер 200–600 нМ Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл ДНК 2–9 мкл
(кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3) Общий объём реакции 25 мкл* - В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК. Образцы ДНК внесите отдельно в каждую пробирку, сбросьте капли центрифугированием.
- Если температура отжига праймеров ≥60 °C
Стадия Температура Время Число циклов Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1 Денатурация 95 °C 10 сек 40–50 Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)60–72 °C 30–60 сек - Если температура отжига праймеров <60 °C
Стадия Температура Время Число циклов Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1 Денатурация 95 °C 10 сек 40–50 Отжиг праймеров
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)55–59 °C 10–15 сек Элонгация 72 °C 15–30 сек ! В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95 °C.
-
Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
! При необходимости хранить продукты амплификации при −20 °С.
Программа амплификации:
Для расчёта температуры плавления (Tm) праймеров рекомендуется использовать стандартные инструменты, работающие по алгоритму Nearest-Neighbor (SantaLucia J Jr., 1998). Температура отжига праймеров рассчитывается по формуле Ta=Tm-5 °C.
Хранение: −20 °С.
Число циклов замораживания/размораживания: не более 20.
Срок годности: 12 месяцев с даты поставки при соблюдении условий хранения и транспортировки.
您的购物车是空的
$ 
