此页面上的某些内容不提供英文版本，默认显示为当前可用的语言。

Реакционная смесь для ПЦР/кПЦР ProbeMaster®️ UDG, 5x

Смесь PCR/qPCR c UDG подходит как для проведения количественной ПЦР, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. Готовая 5-кратная реакционная смесь содержит необходимые компоненты для проведения ПЦР, ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации (содержит Hot-start полимеразу), а урацил-ДНК-гликозилаза исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов. В случае постановки реакции кПЦР, для детекции флуоресценции следует использовать ДНК-зонд, меченный флуорофором и тушителем (гидролизуемые зонды, «молекулярные маяки», праймеры типа «скорпион») или два зонда, меченных флуорофорами, образующими FRET-пару (вы можете заказать синтез зондов в Lumiprobe). Помимо ДНК-зондов, для детекции флуоресценции может использоваться интеркалирующий краситель dsGreen (dsGreen). Объем смеси 1 мл рассчитан на проведение 200 реакций объемом 25 мкл.

Состав реакционной смеси: HS Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP), урацил-ДНК-гликозилаза (UDG), ПЦР-буфер (содержит Mg2+ с концентрацией 3 мМ в 1х реакционной смеси).

Совместимость с оборудованием: совместим с амплификаторами любого типа.

Возможные приложения: качественная и количественная ПЦР с детекцией продуктов амплификации как в режиме реального времени, так и с помощью гель-электрофореза, ПЦР после обратной транскрипции.

Протокол

  1. Разморозьте реакционную смесь при комнатной температуре, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
  2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
    ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в 2 и более повторах для каждого образца ДНК.
    ! Объем реакции может варьироваться в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется.
    3. Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл с детекцией в режиме реального времени:
    Компонент Объем Примечание
    5х Реакционная смесь PCR/qPCR с UDG 5 мкл
    Прямой праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию
    (конечная концентрация 200–600 нМ)
    Обратный праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора
    Зонд
    — или — Интеркалирующий краситель     		0.25–0.75 мкл 10 мкМ раствора 2.5–7.5 пмоль/реакцию
    (конечная концентрация 100–300 нМ)
    Согласно рекомендации производителя
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл
    ДНК 2–9 мкл
    (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)     		Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3)
    Общий объём реакции 25 мкл*
    * при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
    Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл с детекцией методом гель-электрофореза:
    Компонент Объем Примечание
    5х Реакционная смесь PCR/qPCR c UDG 5 мкл
    Прямой праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ)
    Обратный праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл
    ДНК 2–9 мкл
    (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)     		Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3)
    Общий объём реакции 25 мкл*
    * при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
  3. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК. Образцы ДНК внесите отдельно в каждую пробирку, закройте крышки пробирок, стрипов или заклейте планшет плёнкой, сбросьте капли центрифугированием.

    4. Программа амплификации

    Для расчёта температуры плавления (Tm) праймеров рекомендуется использовать стандартные инструменты, работающие по алгоритму Nearest-Neighbor (SantaLucia J Jr., 1998). Температура отжига праймеров рассчитывается по формуле Ta=Tm-5 °C.

    • Если температура отжига праймеров ≥60 °C
      Стадия Температура Время Число циклов
      Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1
      Денатурация 95 °C 10 сек 40
      Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
      (На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)       		60–72 °C 30–60 сек
    • Если температура отжига праймеров <60 °C
      Стадия Температура Время Число циклов
      Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1
      Денатурация 95 °C 10 сек 40
      Отжиг праймеров
      (На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)      		 55–59 °C 10–15 сек
      Элонгация 72 °C 15–30 сек

      ! В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95 °C.

  4. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.

    ! При необходимости хранить продукты амплификации при −20 °С.

Хранение: −20 °С.

Число циклов замораживания/размораживания: не более 20.

Срок годности: 12 месяцев с даты поставки при соблюдении условий хранения и транспортировки.

您的商品已添加. 查看您的 购物车 或者 继续结账
商品数量不正确.